Práctica 23 (2ºTRI): HIERRO

Determinación cuantitativa de hierro 

Principio:

El hierro se disocia del complejo sérico hierro-transferrina en medio ácido débil. El hierro libre se reduce a ion ferroso mediante el ácido ascórbico. Los iones ferrosos en presencia de FerroZine forma un complejo coloreado. La intensidad del color es proporcional a la concentración de hierro en la muestra.

Significado:

El hierro es necesario para la producción de hemoglobina. Su déficit causa anemia ferropénica. Se encuentran niveles elevados de hierro en la hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda y en concentraciones altas de transferrina. La variación día a día es común en poblaciones sanas.
El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Reactivo:

R1Tampón Acetato
R2 Reductor Ácido ascórbico
Color FerroZine
IRON CAL Patrón primario acuoso de Hierro

Material:

• Pipetas automáticas y puntas
• Pipetas pasteur
• Tubo de ensayo de 3 ml
• Tapones
• Cubo para desechos

Muestra:

- Suero o plasma heparinizado

Procedimiento:

1. Utilizamos como muestra para estas mediciones el sobrenadante que obtuvimos en la TIBC.
2. Pipeteamos en los tubos.
3. En el blanco de reactivo ponemos 1,0 ml de RT + 1 gota de R3 + 200 ul agua destilada
4. En el patrón ponemos 1,0 ml de RT + 1 gota de R3 + 200 ul de patrón
5. Blanco muestra ponemos 1,0 ml de RT + 200 ul de muestra.
6. Muestra ponemos 1,0 ml de RT + 1 gota de R3 + 200 ul de muestra.
7. Medimos las absorbancias

Cálculo de absorbancias: 0,099/0,086 x 100 = 115,12 g/dL de Hierro en la muestra.

Cá lculo de CFTH = 345’35

Práctica 22 (2ºTRI): CFTH

Reactivo saturante – precipitante de capacidad de fijación total del hierro (CFTH)

Principio:

La transferrina sérica se satura con un exceso de Fe3+ y el exceso no fijado se elimina por precipitación con carbonato magnésico, pudiendo saber así la cantidad total de hierro presente. La diferencia entre la capacidad de fijación total de hierro hallada (CFTH) y el hierro sérico inicial (Hb) nos da la capacidad de fijación de hierro no saturado o residual.

Significado:

Encontramos niveles altos de CFTH en la anemia ferropénica. Niveles bajos en hemocromatosis, cirrosis y hepatitis aguda. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Aparatos:

- Centrífuga

Material:

• Pipetas automáticas y puntas
• Pipetas pasteur
• Tubo de ensayo de 3 ml
• Tapones
• Cubo para desechos

Reactivo:

• R5 Solución saturante
• R6 agente precipitante 

Muestra:

- Suero o plasma

Procedimiento:

1. Pipetear en tubo 0,5 ml de muestra y 1 ml de R5.
2. Mezclar e incubar durante 10 minutos a tª ambiente.
3. Añadimos R6, mezclamos.
4. Incubamos durante 10 minutos.
5. Centrifugamos a 3000 rpm durante 15 minutos.
6. Recogemos el sobrenadante para usar en la siguiente práctica.

Práctica 21 (2ºTRI): Reticulocitos

Determinación del porcentaje de reticulocitos (RET)

El objetivo de esta prueba es determinar el RET por un número determinado de hematíes, calcular el número de reticulocitos que hay en sangre, valorar RET y la actividad eritropoyética.

Material:

• Lancetas
• Portaobjetos
• Alcohol
• Algodón
• Pipetas automáticas y puntas
• Pipetas pasteur
• Tubo de ensayo de 3 ml
• Tapones

Reactivo:

• Colorante azul de cresil brillante

Muestra:

- Sangre anticoagulada

Procedimiento:

1. Primero limpiamos el dedo a pinchar con un algodón empapado en alcohol.
2. Con la ayuda de una pipeta automática de 20 ul cogemos la sangre del dedo pinchado.
3. Ponemos la sangre recogida en un tubo de ensayo. 
4. En el mismo tubo ponemos 20 ul de colorante
5. Tapamos el tubo con parafilm.
6. Mezclamos el tubo suavemente.
7. Dejamos reposar durante 20 minutos.
8. Cuando haya pasado ya el tiempo, homogeneizamos con la ayuda de una pipeta.
9. Destapamos y cogemos un poco de la mezcla.
10. Ponemos una gota en un porta para hacer una extensión.
11. Dejamos secar al aire.
12. Mirar al microscopio.

Práctica 20 (2ºTRI): Hemoglobina

Hemoglobina

Drabkin. Colorimétrico

Principio:

La Hb se oxida con el ferricianuro a metahemoglobina y con el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.

Significado:

La Hb tiene hierro y es lo que colorea la sangre. Transporta oxigeno a la sangre. Cuando los niveles están bajos indica anemia por diferentes causas. Debemos tener en cuenta los datos clínicos y de laboratorio para el diagnóstico.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Papel absorbente
• Tubo de ensayo 10 ml
• Cubetas para espectrofotómetro
• Tapones para tubos

Muestra:

• Sangre capilar o venosa

Aparato: 

• Espectrofotómetro a 540 nm

Reactivos:

• Hemoglobin 50x
• Hemoglobin CAL

Procedimiento:

1. Preparación del RT, En tres tubos ponemos 4,9 ml de agua destilada + 2 gotas de reactivo.
2. Lo primero que debemos de hacer es encender el aparato, para que se vaya calentando.
3. Preparamos 3 tubos: blanco, patrón y muestra.
4. En el blanco pipeteamos 5 ml de RT
5. En el patrón 5 ml de RT + 20 ul de hemoglobin CAL. Mezclamos
6. En la muestra 5 ml de RT + 20 ul de muestra. Mezclamos 
7. Incubamos durante 3 minutos a temperatura ambiente.
8. Leemos la absorbancia con el espectrofotómetro. Primero el blanco para calibrar, luego patrón y por último muestra.
9. Apuntamos todo y hacemos los cálculos correspondientes.

Patrón: 0,396  Muestra: 0,317

Cálculo: 0,396/0,317 x 15 = 18,74 g/dL de hemoglobina en la muestra.

*El resultado final se ve alterado (más alto) porque la muestra fue insuficiente.

Práctica 19 (2ºTRI): LEUCOGNOST-ALPA

Identificación de la actividad de la fosfatasa alcalina en leucocitos

Principio:

La fosfatasa alcalina de leucocito ría cataliza la hidrólisis de ésteres fosfóricos en medio alcalino. El 1-naftol liberado a partir del fosfato de 1-naftilo se acopla con una sal de diazonio para dar un azocolorante pardo, que precipita en la célula de acuerdo con la localización y la actividad de la fosfatasa alcalina en la célula.

Reactivo:

- LEUCOGNOST-ALPA

- Tres tipos de reactivos en el kit

Material:

• Cubos para desecho
• Cubeta para tinción
• Probeta
• Pipetas automáticas y puntas
• Pipeta graduada
• Vaso de precipitados 

Procedimiento:

1. Se realizan los preparados para el tinte.
2. Primero metemos los portas en una solución fijadora durante 2 minutos.
3. Enjuagamos con agua del grifo durante 10 segundas. Dejar secar al aire.
4. Ponemos los portas en la tinción durante 30 minutos.
5. Metemos en un vaso de precipitados con agua destilada durante 5 minutos.
6. Ponemos en contratinción durante 5 minutos.
7. Lavamos bajo grifo durante 5 minutos.
8. Dejamos secar al aire.

Práctica 18 (2TRI): LEUCOGNOST POX

Detección de la reacción de la peroxidasa en leucocitos

Principio:

Esta reacción sirve como indicador para la presencia de elementos celulares mieloicos. La madurez de los granulocitos se da según la intensidad de la reacción cromática pardo-negruzca.

Material:

• Portaobjetos
• Cubetas para tinción
• Papel absorbente
• Cubo para desechos
• Lancetas
• Algodón 
• Alcohol

Procedimiento:

1. Primero se realizan los frotis sanguíneos, hacemos dos por persona, cada uno con su propia muestra.
2. Se introduce el porta en el fijador durante 3 minutos (metanol-formol 9:1)
3. Llevamos a lavar el porta con agua normal del grifo y dejamos secar totalmente al aire.
4. Introducir en tención durante 10 minutos y lavamos.
5. Ponemos la contratinción durante 2 minutos.
6. Lavar el porta bajo el grifo durante 3 minutos.
7. Dejar secar y mirar al microscopio.

                                                  

                                                 

                                                  

    

Práctica 15 (2ºTRI): Tiempo de sangría

Tiempo de hemorragia

Es el tiempo que transcurre desde que se puncionan los capilares hasta la formación del agregado plaquetar.

Con el se mide la capacidad de los capilares para responder a una lesión, lo que depende de la integridad de la pared vascular, de su capacidad constrictora y del número y calidad de las plaquetas que formarán el tapón hemostático. Un tiempo de hemorragia prolongado se da cuando la cifra de plaquetas es inferior a 100.000/3 mm.

Método de Duke

Material:

• Pipetas automáticas
• Puntas de pipeta
• Cronómetro
• Papel de filtro
• Algodón
• Lancetas
• Alcohol

Procedimiento:

1. Se limpia el lóbulo de la oreja con el algodón mojado en alcohol.
2. Pinchamos el lóbulo y ponemos en marcha el cronómetro.
3. Limpiamos la sangre que haya salido a los 30 segundos, así cada 30, hasta que pare de sangrar.
4. Cuando de sangrar también se para el cronómetro y se apunta el tiempo transcurrido.

Resultado: 1.1’