Práctica 23 (2ºTRI): HIERRO

Determinación cuantitativa de hierro 

Principio:

El hierro se disocia del complejo sérico hierro-transferrina en medio ácido débil. El hierro libre se reduce a ion ferroso mediante el ácido ascórbico. Los iones ferrosos en presencia de FerroZine forma un complejo coloreado. La intensidad del color es proporcional a la concentración de hierro en la muestra.

Significado:

El hierro es necesario para la producción de hemoglobina. Su déficit causa anemia ferropénica. Se encuentran niveles elevados de hierro en la hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda y en concentraciones altas de transferrina. La variación día a día es común en poblaciones sanas.
El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Reactivo:

R1Tampón Acetato
R2 Reductor Ácido ascórbico
Color FerroZine
IRON CAL Patrón primario acuoso de Hierro

Material:

• Pipetas automáticas y puntas
• Pipetas pasteur
• Tubo de ensayo de 3 ml
• Tapones
• Cubo para desechos

Muestra:

- Suero o plasma heparinizado

Procedimiento:

1. Utilizamos como muestra para estas mediciones el sobrenadante que obtuvimos en la TIBC.
2. Pipeteamos en los tubos.
3. En el blanco de reactivo ponemos 1,0 ml de RT + 1 gota de R3 + 200 ul agua destilada
4. En el patrón ponemos 1,0 ml de RT + 1 gota de R3 + 200 ul de patrón
5. Blanco muestra ponemos 1,0 ml de RT + 200 ul de muestra.
6. Muestra ponemos 1,0 ml de RT + 1 gota de R3 + 200 ul de muestra.
7. Medimos las absorbancias

Cálculo de absorbancias: 0,099/0,086 x 100 = 115,12 g/dL de Hierro en la muestra.

Cá lculo de CFTH = 345’35

Práctica 22 (2ºTRI): CFTH

Reactivo saturante – precipitante de capacidad de fijación total del hierro (CFTH)

Principio:

La transferrina sérica se satura con un exceso de Fe3+ y el exceso no fijado se elimina por precipitación con carbonato magnésico, pudiendo saber así la cantidad total de hierro presente. La diferencia entre la capacidad de fijación total de hierro hallada (CFTH) y el hierro sérico inicial (Hb) nos da la capacidad de fijación de hierro no saturado o residual.

Significado:

Encontramos niveles altos de CFTH en la anemia ferropénica. Niveles bajos en hemocromatosis, cirrosis y hepatitis aguda. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Aparatos:

- Centrífuga

Material:

• Pipetas automáticas y puntas
• Pipetas pasteur
• Tubo de ensayo de 3 ml
• Tapones
• Cubo para desechos

Reactivo:

• R5 Solución saturante
• R6 agente precipitante 

Muestra:

- Suero o plasma

Procedimiento:

1. Pipetear en tubo 0,5 ml de muestra y 1 ml de R5.
2. Mezclar e incubar durante 10 minutos a tª ambiente.
3. Añadimos R6, mezclamos.
4. Incubamos durante 10 minutos.
5. Centrifugamos a 3000 rpm durante 15 minutos.
6. Recogemos el sobrenadante para usar en la siguiente práctica.

Práctica 21 (2ºTRI): Reticulocitos

Determinación del porcentaje de reticulocitos (RET)

El objetivo de esta prueba es determinar el RET por un número determinado de hematíes, calcular el número de reticulocitos que hay en sangre, valorar RET y la actividad eritropoyética.

Material:

• Lancetas
• Portaobjetos
• Alcohol
• Algodón
• Pipetas automáticas y puntas
• Pipetas pasteur
• Tubo de ensayo de 3 ml
• Tapones

Reactivo:

• Colorante azul de cresil brillante

Muestra:

- Sangre anticoagulada

Procedimiento:

1. Primero limpiamos el dedo a pinchar con un algodón empapado en alcohol.
2. Con la ayuda de una pipeta automática de 20 ul cogemos la sangre del dedo pinchado.
3. Ponemos la sangre recogida en un tubo de ensayo. 
4. En el mismo tubo ponemos 20 ul de colorante
5. Tapamos el tubo con parafilm.
6. Mezclamos el tubo suavemente.
7. Dejamos reposar durante 20 minutos.
8. Cuando haya pasado ya el tiempo, homogeneizamos con la ayuda de una pipeta.
9. Destapamos y cogemos un poco de la mezcla.
10. Ponemos una gota en un porta para hacer una extensión.
11. Dejamos secar al aire.
12. Mirar al microscopio.

Práctica 20 (2ºTRI): Hemoglobina

Hemoglobina

Drabkin. Colorimétrico

Principio:

La Hb se oxida con el ferricianuro a metahemoglobina y con el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.

Significado:

La Hb tiene hierro y es lo que colorea la sangre. Transporta oxigeno a la sangre. Cuando los niveles están bajos indica anemia por diferentes causas. Debemos tener en cuenta los datos clínicos y de laboratorio para el diagnóstico.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Papel absorbente
• Tubo de ensayo 10 ml
• Cubetas para espectrofotómetro
• Tapones para tubos

Muestra:

• Sangre capilar o venosa

Aparato: 

• Espectrofotómetro a 540 nm

Reactivos:

• Hemoglobin 50x
• Hemoglobin CAL

Procedimiento:

1. Preparación del RT, En tres tubos ponemos 4,9 ml de agua destilada + 2 gotas de reactivo.
2. Lo primero que debemos de hacer es encender el aparato, para que se vaya calentando.
3. Preparamos 3 tubos: blanco, patrón y muestra.
4. En el blanco pipeteamos 5 ml de RT
5. En el patrón 5 ml de RT + 20 ul de hemoglobin CAL. Mezclamos
6. En la muestra 5 ml de RT + 20 ul de muestra. Mezclamos 
7. Incubamos durante 3 minutos a temperatura ambiente.
8. Leemos la absorbancia con el espectrofotómetro. Primero el blanco para calibrar, luego patrón y por último muestra.
9. Apuntamos todo y hacemos los cálculos correspondientes.

Patrón: 0,396  Muestra: 0,317

Cálculo: 0,396/0,317 x 15 = 18,74 g/dL de hemoglobina en la muestra.

*El resultado final se ve alterado (más alto) porque la muestra fue insuficiente.

Práctica 19 (2ºTRI): LEUCOGNOST-ALPA

Identificación de la actividad de la fosfatasa alcalina en leucocitos

Principio:

La fosfatasa alcalina de leucocito ría cataliza la hidrólisis de ésteres fosfóricos en medio alcalino. El 1-naftol liberado a partir del fosfato de 1-naftilo se acopla con una sal de diazonio para dar un azocolorante pardo, que precipita en la célula de acuerdo con la localización y la actividad de la fosfatasa alcalina en la célula.

Reactivo:

- LEUCOGNOST-ALPA

- Tres tipos de reactivos en el kit

Material:

• Cubos para desecho
• Cubeta para tinción
• Probeta
• Pipetas automáticas y puntas
• Pipeta graduada
• Vaso de precipitados 

Procedimiento:

1. Se realizan los preparados para el tinte.
2. Primero metemos los portas en una solución fijadora durante 2 minutos.
3. Enjuagamos con agua del grifo durante 10 segundas. Dejar secar al aire.
4. Ponemos los portas en la tinción durante 30 minutos.
5. Metemos en un vaso de precipitados con agua destilada durante 5 minutos.
6. Ponemos en contratinción durante 5 minutos.
7. Lavamos bajo grifo durante 5 minutos.
8. Dejamos secar al aire.

Práctica 18 (2TRI): LEUCOGNOST POX

Detección de la reacción de la peroxidasa en leucocitos

Principio:

Esta reacción sirve como indicador para la presencia de elementos celulares mieloicos. La madurez de los granulocitos se da según la intensidad de la reacción cromática pardo-negruzca.

Material:

• Portaobjetos
• Cubetas para tinción
• Papel absorbente
• Cubo para desechos
• Lancetas
• Algodón 
• Alcohol

Procedimiento:

1. Primero se realizan los frotis sanguíneos, hacemos dos por persona, cada uno con su propia muestra.
2. Se introduce el porta en el fijador durante 3 minutos (metanol-formol 9:1)
3. Llevamos a lavar el porta con agua normal del grifo y dejamos secar totalmente al aire.
4. Introducir en tención durante 10 minutos y lavamos.
5. Ponemos la contratinción durante 2 minutos.
6. Lavar el porta bajo el grifo durante 3 minutos.
7. Dejar secar y mirar al microscopio.

                                                  

                                                 

                                                  

    

Práctica 15 (2ºTRI): Tiempo de sangría

Tiempo de hemorragia

Es el tiempo que transcurre desde que se puncionan los capilares hasta la formación del agregado plaquetar.

Con el se mide la capacidad de los capilares para responder a una lesión, lo que depende de la integridad de la pared vascular, de su capacidad constrictora y del número y calidad de las plaquetas que formarán el tapón hemostático. Un tiempo de hemorragia prolongado se da cuando la cifra de plaquetas es inferior a 100.000/3 mm.

Método de Duke

Material:

• Pipetas automáticas
• Puntas de pipeta
• Cronómetro
• Papel de filtro
• Algodón
• Lancetas
• Alcohol

Procedimiento:

1. Se limpia el lóbulo de la oreja con el algodón mojado en alcohol.
2. Pinchamos el lóbulo y ponemos en marcha el cronómetro.
3. Limpiamos la sangre que haya salido a los 30 segundos, así cada 30, hasta que pare de sangrar.
4. Cuando de sangrar también se para el cronómetro y se apunta el tiempo transcurrido.

Resultado: 1.1’

Práctica 17 (2ºTRI): Determinación cuantitativa de Fibrinógeno

Determinación cuantitativa de Fibrinógeno 

Principio:

El Fibrinógeno se convierte en Fibrina cuando hay mucha trombina.
El tiempo de formación del coágulo es inversamente  proporcional a la concentración de Fibrinógeno presente en la muestra de plasma.

Significado:

El Fibrinógeno es una proteína sintetizada en el hígado, es usado para formar el coágulo. Su determinación nos ayuda a evaluar las alteraciones en los mecanismos de coagulación.  La concentración se ve en inflamaciones agudas y embarazo. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Papel absorbente
• Tubo de ensayo 3 ml x 3

Muestra:

• Plasma

Aparato: 

• Coagulómetro

Reactivos:

• R1 trombina bovina
• R2 tampón imidazol
• R3 solución caolín
• Control normal y patológico 

Procedimiento:

1. Calentar los reactivos a usar a 37ºC, también la muestra.
2. Mezclarlos bien los reactivos.
3. Realizar igual que los demás en el coagulómetro. 
4. Apuntar.
Resultados: 21:6’’ (control normal)
25:7’’ (control patológico)
16:6 (muestra)

Práctica 16 (2TRI): Determinación del Tiempo de Protrombina (PT)

Determinación del Tiempo de Protrombina (PT) 

Principio:

Se trata de medir el tiempo transcurrido en la formación del coágulo después de la mezcla del plasma con Tromboplastina. La coagulación se inicia por activación del Factor VII con el Factor Tisular.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Papel absorbente
• Tubo de ensayo 3 ml 

Muestra:

• Sangre

Reactivos:

• Reactivo PT

Procedimiento:

1. Calentar los reactivos a usar a 37ºC, también la muestra.
2. Mezclarlos bien los reactivos.
3. Pipetear en un tubo de ensayo 200 ul del reactivo y 100 de muestra.
4. Empezar a contar el tiempo transcurrido en el momento de la mezcla. Detener en el momento de la formación del coágulo. 
5. Apuntar
Resultado: 12:3’’

Práctica 14 (2ºTRI): Determinación cuantitativa del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT)

Determinación cuantitativa del Tiempo de Tromboplastina 

Parcial Activada (APTT)

Principio:

Se trata de medir el tiempo transcurrido después de la adición del cloruro cálcico (CaCl2) hasta la formación del coágulo de fibrina.

Significado:

Esta medida trata sobre la determinación más común junto con la PT, sirve para ver trastornos de la coagulación siendo sensible a los defectos de la coagulación intrínseca.
Se suele utilizar para controlar terapias de anticoagulantes con heparina. Para realizar el diagnóstico se debe tener en cuenta los demás datos clínicos y de laboratorio.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Papel absorbente
• Tubo de ensayo 3 ml 

Muestra:

• Plasma

Reactivos:

• Control normal
• Control patológico
• Calibrador coagulómetro

Procedimiento:

1. Calentar los reactivos a usar a 37ºC, también la muestra.
2. Mezclarlos bien los reactivos.
3. Pipetear en un tubo de ensayo 100 ul de plasma y 100 de R1.
4. Mezclamos bien y atemperarlos a 37ºC durante 5 minutos.
5. Pipetear 100 ul de R2 y mezclamos.
6. Esperar hasta que se forme el cálculo (hasta que se detenga el coagulómetro)
7. Apuntar los segundos.

Resultado: 61.2’’

Práctica 13 (2ºTRI): Determinación de coombs indirecto

Determinación de coombs indirecto

Con esta practica buscamos la presencia de Ac irregulares o incompletos en el suero del paciente, estos los enfrentaremos a hematíes tapados y luego a la AGH.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Tubos de ensayo de 3 ml
• Pipetas pasteur

Muestra:

• Suero problema

Reactivos:

• AGH y SF
• Hematíes tirados del grupo O+

Procedimiento:

- Preparación de los hematíes tipados O+:

              A) Realizar lavado y dilución de los hematíes tipados O+ Al 5% como ya hicimos en
                   prácticas anteriores.

              B) Usamos lo ya hecho en los anticuerpos irregulares

- Técnica

1. En un tubo ponemos 4 gotas del suero problema.
2. Añadir al tubo anterior 4 gotas de la suspensión de hematíes O+ y agitamos suavemente con los dedos, dando golpecitos.
3. Llevamos a incubar el tubo al baño durante 20 minutos.
4. Lavamos la mezcla añadiendo 1 ml de SF.
5. Repetimos el lavado una vez más.
6. Al sedimento le ponemos 4 gotas de AGH. 
7. Llevamos a centrifugar el tubo a 2500 rpm durante 1 minuto.
8. Resuspendemos el sedimento dando pequeños golpes en la mesa o con los dedos en la parte inferior del tubo.
9. Observamos. Vemos que hay ausencia de aglutinación.

Práctica 12 (2ºTRI): Determinación de Coombs directo en tubo

Determinación de Coombs directo en tubo

Con esta práctica se busca determinar la existencia o no de Ac irregulares o incompletos fijados en la membrana de los hematíes del paciente.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Tubos de ensayo de 3 ml
• Pipetas pasteur

Muestra:

• Sangre anticoagulada (hematíes RH+)

Reactivos:

• AGH y SF
• Hematíes control sensibilizados con IgG (industrial)

Procedimiento:

- Preparación de lavado de hematíes:

              A) En un tubo de 3 ml ponemos 0,5 ml de hematíes y terminar de llenarlo con SSF, ponemos tapón.

              B) Llevamos a centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos.
              C) Repetimos los pasos anteriores una vez más.

- Técnica

1. Cogemos 50 ul de la sangre al 5% + lavado de hematíes + 500 ul de SSF, en un tubo.
2. Echamos 4 gotas de AGH (bote líquido verde) en otro tubo.
3. Echamos 4 gotas de la suspensión de hematíes (preparado en paso 1) en tubo anterior.
4. Centrifugamos el tubo a 2000 rpm durante 1 minuto.
5. Resuspendemos el tubo dando pequeños golpe en la mesa y leemos.

Práctica 11 (2º trimestre): Confirmación del grupo sanguíneo A,B y D combinado con la determinación de anticuerpos irregulares

Confirmación del grupo sanguíneo A,B y D combinado con la determinación de anticuerpos irregulares

Principio:

Además de la confirmación del grupo sanguíneo ABO y RhD del receptor esta prueba sirve para verificar la presencia de anticuerpos irregulares con la prueba de antiglobulina indirecta (PAI) (LISS/Coombs) por medio de 3 hematíes reactivo (ID-DiaCell I-II-III).

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Papel film
• Tijeras

Muestra:

• Plasma o suero
• Suspensión de hematíes 

Reactivos:

• ID-diluent (usamos SSF)
• ID-DiaCell I-II-III

Procedimiento:

- Preparación de la muestra (hematíes al 5%):

              A) En un tubo de 3 ml ponemos 0,5 ml SSF.

              B) Agregar 50 ul de sangre al mismo

- Técnica

1. Abrimos la tarjeta, lo haremos conforme vayamos usando los pocillos, no abrirla entera.
2. Pipeteamos en los pocillos 1, 2 y 3 10 ul de la suspensión de hematíes al 5% que preparamos anteriormente.
3. Pipeteamos 50 ul de ID-DiaCell I-II-III en los tres últimos pocillos.

                                                      

      4.Añadimos 25 ul de plasma en los pocillos 4, 5 y 6.

      5.Llevamos a incubar la tarjeta a 37ºC durante 15 minutos.

                                                           

1. Retiramos del baño, la secamos con un papel absorbente y la llevamos a la centrífuga de tarjeta DiaCell. 
2. Leemos.