Práctica 17 (2ºTRI): Determinación cuantitativa de Fibrinógeno

Determinación cuantitativa de Fibrinógeno 

Principio:

El Fibrinógeno se convierte en Fibrina cuando hay mucha trombina.
El tiempo de formación del coágulo es inversamente  proporcional a la concentración de Fibrinógeno presente en la muestra de plasma.

Significado:

El Fibrinógeno es una proteína sintetizada en el hígado, es usado para formar el coágulo. Su determinación nos ayuda a evaluar las alteraciones en los mecanismos de coagulación.  La concentración se ve en inflamaciones agudas y embarazo. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Papel absorbente
• Tubo de ensayo 3 ml x 3

Muestra:

• Plasma

Aparato: 

• Coagulómetro

Reactivos:

• R1 trombina bovina
• R2 tampón imidazol
• R3 solución caolín
• Control normal y patológico 

Procedimiento:

1. Calentar los reactivos a usar a 37ºC, también la muestra.
2. Mezclarlos bien los reactivos.
3. Realizar igual que los demás en el coagulómetro. 
4. Apuntar.
Resultados: 21:6’’ (control normal)
25:7’’ (control patológico)
16:6 (muestra)

Práctica 16 (2TRI): Determinación del Tiempo de Protrombina (PT)

Determinación del Tiempo de Protrombina (PT) 

Principio:

Se trata de medir el tiempo transcurrido en la formación del coágulo después de la mezcla del plasma con Tromboplastina. La coagulación se inicia por activación del Factor VII con el Factor Tisular.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Papel absorbente
• Tubo de ensayo 3 ml 

Muestra:

• Sangre

Reactivos:

• Reactivo PT

Procedimiento:

1. Calentar los reactivos a usar a 37ºC, también la muestra.
2. Mezclarlos bien los reactivos.
3. Pipetear en un tubo de ensayo 200 ul del reactivo y 100 de muestra.
4. Empezar a contar el tiempo transcurrido en el momento de la mezcla. Detener en el momento de la formación del coágulo. 
5. Apuntar
Resultado: 12:3’’

Práctica 14 (2ºTRI): Determinación cuantitativa del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT)

Determinación cuantitativa del Tiempo de Tromboplastina 

Parcial Activada (APTT)

Principio:

Se trata de medir el tiempo transcurrido después de la adición del cloruro cálcico (CaCl2) hasta la formación del coágulo de fibrina.

Significado:

Esta medida trata sobre la determinación más común junto con la PT, sirve para ver trastornos de la coagulación siendo sensible a los defectos de la coagulación intrínseca.
Se suele utilizar para controlar terapias de anticoagulantes con heparina. Para realizar el diagnóstico se debe tener en cuenta los demás datos clínicos y de laboratorio.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Papel absorbente
• Tubo de ensayo 3 ml 

Muestra:

• Plasma

Reactivos:

• Control normal
• Control patológico
• Calibrador coagulómetro

Procedimiento:

1. Calentar los reactivos a usar a 37ºC, también la muestra.
2. Mezclarlos bien los reactivos.
3. Pipetear en un tubo de ensayo 100 ul de plasma y 100 de R1.
4. Mezclamos bien y atemperarlos a 37ºC durante 5 minutos.
5. Pipetear 100 ul de R2 y mezclamos.
6. Esperar hasta que se forme el cálculo (hasta que se detenga el coagulómetro)
7. Apuntar los segundos.

Resultado: 61.2’’

Práctica 13 (2ºTRI): Determinación de coombs indirecto

Determinación de coombs indirecto

Con esta practica buscamos la presencia de Ac irregulares o incompletos en el suero del paciente, estos los enfrentaremos a hematíes tapados y luego a la AGH.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Tubos de ensayo de 3 ml
• Pipetas pasteur

Muestra:

• Suero problema

Reactivos:

• AGH y SF
• Hematíes tirados del grupo O+

Procedimiento:

- Preparación de los hematíes tipados O+:

              A) Realizar lavado y dilución de los hematíes tipados O+ Al 5% como ya hicimos en
                   prácticas anteriores.

              B) Usamos lo ya hecho en los anticuerpos irregulares

- Técnica

1. En un tubo ponemos 4 gotas del suero problema.
2. Añadir al tubo anterior 4 gotas de la suspensión de hematíes O+ y agitamos suavemente con los dedos, dando golpecitos.
3. Llevamos a incubar el tubo al baño durante 20 minutos.
4. Lavamos la mezcla añadiendo 1 ml de SF.
5. Repetimos el lavado una vez más.
6. Al sedimento le ponemos 4 gotas de AGH. 
7. Llevamos a centrifugar el tubo a 2500 rpm durante 1 minuto.
8. Resuspendemos el sedimento dando pequeños golpes en la mesa o con los dedos en la parte inferior del tubo.
9. Observamos. Vemos que hay ausencia de aglutinación.

Práctica 12 (2ºTRI): Determinación de Coombs directo en tubo

Determinación de Coombs directo en tubo

Con esta práctica se busca determinar la existencia o no de Ac irregulares o incompletos fijados en la membrana de los hematíes del paciente.

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Tubos de ensayo de 3 ml
• Pipetas pasteur

Muestra:

• Sangre anticoagulada (hematíes RH+)

Reactivos:

• AGH y SF
• Hematíes control sensibilizados con IgG (industrial)

Procedimiento:

- Preparación de lavado de hematíes:

              A) En un tubo de 3 ml ponemos 0,5 ml de hematíes y terminar de llenarlo con SSF, ponemos tapón.

              B) Llevamos a centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos.
              C) Repetimos los pasos anteriores una vez más.

- Técnica

1. Cogemos 50 ul de la sangre al 5% + lavado de hematíes + 500 ul de SSF, en un tubo.
2. Echamos 4 gotas de AGH (bote líquido verde) en otro tubo.
3. Echamos 4 gotas de la suspensión de hematíes (preparado en paso 1) en tubo anterior.
4. Centrifugamos el tubo a 2000 rpm durante 1 minuto.
5. Resuspendemos el tubo dando pequeños golpe en la mesa y leemos.

Práctica 11 (2º trimestre): Confirmación del grupo sanguíneo A,B y D combinado con la determinación de anticuerpos irregulares

Confirmación del grupo sanguíneo A,B y D combinado con la determinación de anticuerpos irregulares

Principio:

Además de la confirmación del grupo sanguíneo ABO y RhD del receptor esta prueba sirve para verificar la presencia de anticuerpos irregulares con la prueba de antiglobulina indirecta (PAI) (LISS/Coombs) por medio de 3 hematíes reactivo (ID-DiaCell I-II-III).

Materiales:

• Pipetas automáticas 
• Puntas de pipeta
• Cubo para desechos
• Papel film
• Tijeras

Muestra:

• Plasma o suero
• Suspensión de hematíes 

Reactivos:

• ID-diluent (usamos SSF)
• ID-DiaCell I-II-III

Procedimiento:

- Preparación de la muestra (hematíes al 5%):

              A) En un tubo de 3 ml ponemos 0,5 ml SSF.

              B) Agregar 50 ul de sangre al mismo

- Técnica

1. Abrimos la tarjeta, lo haremos conforme vayamos usando los pocillos, no abrirla entera.
2. Pipeteamos en los pocillos 1, 2 y 3 10 ul de la suspensión de hematíes al 5% que preparamos anteriormente.
3. Pipeteamos 50 ul de ID-DiaCell I-II-III en los tres últimos pocillos.

                                                      

      4.Añadimos 25 ul de plasma en los pocillos 4, 5 y 6.

      5.Llevamos a incubar la tarjeta a 37ºC durante 15 minutos.

                                                           

1. Retiramos del baño, la secamos con un papel absorbente y la llevamos a la centrífuga de tarjeta DiaCell. 
2. Leemos.

Práctica 10 (primer trimestre)

Fenotipo y genotipo

Objetivo:

• Saber el genotipo más probable del sistema RH enfrentando los hematíes problema a distintos sueros que contienen anticuerpos dirigidos contra los antígenos que componen el sistema RH.

Material:

• Pipetas automáticas
• Puntas de pipeta
• Tubos de ensayo
• Tapones
• Parafilm
• Gradilla
• Vaso para desechos

Reactivos:

• SF
• Anti-A (A)
• Anti-B (B)
• Anti-AB (AB)
• Anti-D (D)
• Autocontrol Rh (CD)

Muestra:

• Suspensión de hematíes problema lavados al 5% en SF

Procedimiento:

• Realizar un lavado de hematíes de la muestra y una dilución al 5% como anteriormente ya hemos realizado en prácticas anteriores.
• Preparamos dos filas de 6 tubos de ensayo en las gradillas, y rotulamos con D, E, C, e, c y CD. En la primera fila ponemos la sangre A, y en la segunda B.
• Echamos 4 gotas del antisuero correspondiente a todos los tubos, y 4 gotas de la sangre que diluimos.
• Llevamos a la centrífuga un minuto a 1000 rpm.
• Resuspendemos dando pequeños golpes encima de la mesa.
• Observamos resultado.

Resultados:

• En la segunda fila (sangre B), tenemos aglutinación en D y C.

Madeleine Guerra Delgado 2ºLCB